BY: 苦难与荣耀

接续：连系新冠病毒与Ralph S. Baric的双纽带（下）
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论文B-4 6park.com
2008年9月1日（Published online 2008 Jun 25），Ralph S. Baric等人在Journal of Virology发表了论文：Pathways of Cross-Species Transmission of Synthetically Reconstructed Zoonotic Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus（人畜共患严重急性呼吸综合征冠状病毒的跨物种传播途径）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2519660/
https://journals.asm.org/doi/10.1128/JVI.00818-08 6park.com
Ralph S. Baric依然是论文的通讯作者。 6park.com
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论文B-4是论文B-3研究的延续。 6park.com
论文研究了7种病毒对不同细胞的感染能力，它们是：
病毒1：嵌合病毒icSZ16-S，它的刺突蛋白来自果子狸冠状病毒SZ16，骨架来自SARS病毒株Urbani，
病毒2：icSZ16-S K479N，它是对icSZ16-S的479氨基酸实施人为替换（K479N）后得到的病毒，
病毒3：icSZ16-S K479N D22，它是icSZ16-S K479N在人气道上皮上培养、传代、筛选得到的实验室变异体，
病毒4-6：三个SARS病毒的克隆毒株：icSARS、icCUHK-W1、icGZ02，
病毒7：SARS不同毒株的人工混嵌体icGD03-S，它应该是SARS-GD03的刺突蛋白与SARS-Urbani的骨架嵌合而成的。 6park.com
关于病毒4-6的更多说明：
icSARS是用反向遗传平台合成的SARS-Urbani的克隆，SARS-Urbani是SARS疫情晚期分离自美国的SARS病毒株。
GZ02是SARS疫情早期分离自广州的SARS病毒株。
CUHK-W1是SARS疫情中期分离自香港的SARS病毒株。
GD03是比Urbani更晚的SARS病毒株，它是2004年1月疫情再次零星出现时分离自一散发广东患者的SARS病毒株。
（SARS疫情发生于2002年11月16日－2003年9月2日，高峰期为2002年11月16日－2003年7月16日） 6park.com
论文详尽地列出了所涉及各病毒刺突蛋白的氨基酸差异，并标出了其它6种刺突蛋白相对于SARS-Urbani刺突蛋白的氨基酸差异数，见图D；
论文还细致地列出了cACE2（civet ACE2）及hACE2或primate-ACE2（灵长类动物ACE2）的所有热点氨基酸残基及与它们发生作用或接触的SARS-Urbani的RBD氨基酸残基，见图E。 6park.com
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前一论文（B-3）研究、实验了相关病毒对HAE细胞（人气道上皮细胞）、Vero E6细胞、普通小鼠DBT细胞、转基因小鼠DBT-hACE2细胞的感染复制情况。论文B-4又引入了另一种转基因小鼠DBT细胞：DBT-cACE2，以进一步研究相关病毒的感染、复制能力，对照分析它们的RBD、关键氨基酸与不同ACE2的作用机制。 6park.com
DBT-cACE2细胞是将普通小鼠DBT细胞中的ACE2转基因为cACE2（civet ACE2，果子狸或麝香猫的ACE2）而得到的。 6park.com
相关实验数据见下图。 6park.com

7种病毒对4种细胞中的感染、复制实验数据图。
横坐标是感染后时段，单位为小时；纵坐标是病毒的复制滴度，单位为PFU/ml。
以上实验数据图表明：
a）icSZ16-S K479N、icSZ16-S K479N D22及icCUHK-W1不能在DBT-cACE2细胞中有效复制，或只能低水平复制，而其它病毒，包括icSZ16-S都能在DBT-cACE2细胞中有效复制，见图A； 6park.com
b）icSZ16-S不能在DBT-hACE2细胞中有效复制，而其它病毒都能在DBT-hACE2细胞中不同程度地复制（K479N复制能力相对较差），见图B； 6park.com
c）icSZ16-S不能在Vero E6细胞中有效复制，而其它病毒都能在Vero E6细胞中不同程度地复制，GZ02、CUHK-W1、icSARS、icSZ16-S K479N D22在Vero E6细胞中的复制都极为强烈，见图C； 6park.com
（论文还指出：上述七种病毒皆不能感染未转基因的普通小鼠DBT细胞。） 6park.com
可见，icSZ16-S与icSZ16-S K479N及icSZ16-S K479N D22在细胞感染、复制能力，物种ACE2结合能力上存在巨大差异。 6park.com
icSZ16-S、icSZ16-S K479N二者的刺突蛋白只有一个氨基酸不同，即第479氨基酸，icSZ16-S的第479氨基酸是赖氨酸K，而icSZ16-S K479N的第479氨基酸被人为替换为SARS-Urbani的第479氨基酸--天冬酰胺N（人为制造了K479N突变）。刺突蛋白第479氨基酸是第三个RBD关键氨基酸。 6park.com
icSZ16-S、icSZ16-S K479N D22二者的刺突蛋白有三个氨基酸不同，除了K479N差异外，它们还有另外两个氨基酸差异：Y442F和L472F。刺突蛋白第442、472氨基酸分别是第一、第二个RBD关键氨基酸。 6park.com

相关病毒RBD关键氨基酸对照表
icSZ16-S、K479N、K479N D22这三个病毒在不同物种ACE2结合能力，不同物种细胞感染、复制能力上的巨大差异就是它们RBD关键氨基酸的差异造成的。 6park.com
为了解释各病毒与cACE2、hACE2的不同结合能力，研究者使用RosettaDesign和Modeler软件开发了4种病毒（SARS-Urbani、SZ16、icSZ16-K479N、SZ16-K479N D22）刺突蛋白与cACE2、hACE2相互作用的结构模型，深入分析了各病毒与cACE2、hACE2在各个关键氨基酸位点的作用情况，解读了关键氨基酸差异对hACE2结合能力的影响。论文指出： 6park.com
1）cACE2分子与hACE2分子有两个关键残基（E30和Y34）不同，cACE2的E30和Y34的附加甲基可能会使cACE2结合界面产生明显的突起。SARS-Urbani的RBD能够良好适应hACE2的结合界面，见图A；同时，它又能容纳cACE2的表面突起，见图B。因此，SARS-Urbani对人类和civet（果子狸或麝香猫）有双重宿主适应能力； 6park.com

2）与Urbani RBD类似，SZ16 RBD也能容纳cACE2的E30、Y34造成的表面突起，以实现有效结合，见图C； 6park.com
3）SZ16 K479N中的K479N突变（人为替换）引入的479N（天冬酰胺）重塑了SZ16刺突蛋白的结合界面，促进了其与hACE2的结合，见图D； 6park.com
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4）见图E，479N对SZ16 K479N结合界面的重塑使RBD氨基酸残基（V404、Y440）与cACE2氨基酸残基（E30、Y34）之间产生冲突（绿色表示吻合，褐色表示存在冲突，深褐色表示冲突难以克服的区域），SZ16 K479N RBD无法容纳cACE2的延长突出部分，这阻碍了二者的结合。因此，K479N突变（人为替换）使RBD获得了结合hACE2的能力，但同时失去了结合cACE2的能力； 6park.com
5）在K479N基础上，Y442F和L472F突变进一步重塑了SZ16 K479N D22的RBD，进一步提高了RBD与hACE2的结合效率，见图F； 6park.com
6）与SZ16 K479N一样，SZ16 K479N D22的RBD也不能容纳cACE2的延长突出部分，从而使二者无法结合，见图G。 6park.com
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和论文B-3一样，论文B-4也是功能增益研究论文。本文介绍的四篇论文全都是SARS相关的功能增益研究论文。这四篇论文无一例外，全都得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）的资助、支持。十几年来，NIAID的所长，一直是现白宫首席医学顾问，声称新冠病毒来自自然界的福奇。 6park.com
由论文B-3、B-4可知：
早在2007、2008年，Ralph S. Baric对冠状病毒的RBD关键氨基酸，对它们与ACE2，特别是与hACE2的作用机制，就已经研究得极为深入、透彻了；
早在2007，Ralph S. Baric就已经成功实施了关键氨基酸的人为替换，成功实施了冠状病毒的人类组织适应性培养，成功改造、培养出了能感染人体细胞的实验室病毒。 6park.com
本系列三篇文章结论

1）有人参照WIV1（rs3367）病毒的关键氨基酸，通过氨基酸复用及等价、等效替换，为新冠病毒设计了一套与WIV1的关键氨基酸高度等价、等效的关键氨基酸。 6park.com
2）新冠拥有与WIV1高度等价、等效的关键氨基酸，导致了以下“巧合”：
a)新冠、WIV1的跨物种感染能力都极为强大，难分伯仲；
b)新冠、WIV1的宿主范围都极为广泛，而且，它们的宿主范围高度雷同（它们可感染的物种高度重合）；
c)新冠、WIV1的刺突蛋白都极为适宜结合hACE2，与hACE2的结合亲和力都极为强大。 6park.com
3）新冠病毒关键氨基酸的设计者，即新冠病毒的设计者，极有可能就是Ralph S. Baric，或者Ralph S. Baric团队的某个、某些资深成员。

贴主:hgao于2024_03_26 13:32:12编辑