BY: 苦难与荣耀

本文接续：连系新冠病毒与Ralph S. Baric的双纽带（中）
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论文A-3 6park.com
2017年6月28日，Ralph S. Baric团队（北卡罗来纳大学教堂山分校流行病学系）、范德堡大学医学中心、波兰Jagiellonian University、吉利德科技等单位在《ScienceTranslational Medicine》杂志联合发表了一篇瑞德西韦研究论文：Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses（广谱抗病毒药物 GS-5734可抑制流行性人畜共患冠状病毒） 
https://stm.sciencemag.org/content/9/396/eaal3653
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5567817/ 6park.com
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论文指出：目前正在临床开发的用于治疗埃博拉病毒的GS-5734对多种冠状病毒，包括SARS-CoV和MERS-CoV都有明显的抑制疗效，GS-5734的预防性早期治疗显著降低了肺病毒载量，改善了临床症状以及呼吸功能。 6park.com
论文中的GS-5734是瑞德西韦（Remdesivir）的研发编号。论文研究中，为检验瑞德西韦即GS-5734的广谱抗冠状病毒能力，Ralph S. Baric等人使用反向遗传平台，基于病毒的基因序列，人工合成了7种冠状病毒，其中之一是WIV1，其它六种病毒是：
SARS-CoV（SARS病毒）、
MERS-CoV（中东呼吸综合症病毒）、
HCoV-NL63（人类冠状病毒NL63）、
HKU3（蝙蝠冠状病毒HKU3）、
HKU5（伏翼蝠冠状病毒HKU5）、
SHC014（蝙蝠冠状病毒rsSHC014，论文A-1的病毒主角）。 6park.com
注：伏翼蝙蝠是一种拇指大小、约重4克的蝙蝠，发现于2006年，可能是香港独有的物种。 6park.com
论文比较了诸多冠状病毒（包括WIV1）与SARS病毒、MERS病毒在nsp12辅助蛋白、spike蛋白（刺突蛋白）两个部分上的A.A. identity，并将比较结果以不同颜色形象直观地展示为下图（蓝绿色代表一致度高，红黄色代表一致度低）。
注：A.A.指Amino Acid，A.A. identity即氨基酸序列一致性或相似度。 6park.com
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由图可见，不同冠状病毒刺突蛋白差异较大，而它们的nsp12蛋白则高度保守（一致程度高，变异程度低）。论文指出：nsp12蛋白是广谱抗冠状病毒药物的适宜靶点。 6park.com
论文实验检测了GS-5734对两种冠状病毒MERS、SARS的抑制功效，实验结果以下图展示。 6park.com
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由图A、B可见，随着GS-5734使用浓度的增加，HAE细胞培养物中MERS、SARS病毒的滴度显著下降。
由图C、D可见，随着GS-5734使用浓度的增加，HAE细胞培养物中MERS、SARS病毒ORF1、ORFN两种辅助蛋白的检测值显著下降。 6park.com
图A、B、C、D的横坐标都是GS-5734的单位使用剂量（浓度）；
图A、B的纵坐标是病毒的滴度（每毫升培养物中含有的具有生物活性的病毒颗粒数）；
图C、D的纵坐标分别是ORF1、ORFN两种辅助蛋白RT-PCR相对检测值的对数值。以C图为例，以未施用GS-5734时的检测值为一个基准单位，则当GS-5734施用浓度为1μM时，MERS病毒ORF1蛋白的检测值下降到约10^-2（10的负2次方）个单位（即施用前后检测值的比值约为10^-2），将相对检测值以10为底取对数，所得纵坐标值约为-2。 6park.com
注：HAE细胞，即human airway epithelium cells，人气道上皮细胞。 6park.com
论文接着又实验检测了GS-5734对另外五种冠状病毒（包括WIV1）的抑制能力。仍然使用HAE细胞培养各病毒，与上一组实验不同的是，每个病毒的HAE培养物都一式两份，实验结果见下图。 6park.com

图B中各坐标子图的横坐标都是GS-5734的使用浓度。
上排五个坐标图的纵坐标都是HAE培养物中相应病毒的滴度。由图可见，随着GS-5734使用浓度的增加，培养物中各病毒的滴度显著下降。
下排各坐标图的纵坐标为HAE培养物中各病毒ORF1、ORFN蛋白RT-PCR相对检测值的对数值。由图可见，随着GS-5734的使用浓度的增加，各病毒ORF1、ORFN蛋白的检测值显著下降，当使用浓度为10μM时，相比未施用时，五病毒两辅助蛋白的检测值下降了100~100000倍。 6park.com
Ralph S. Baric是该论文的两个通讯作者之一；论文的第一至第五作者，全都是北卡罗来纳大学教堂山分校的Baric团队成员，其中第四作者，就是论文A-1、A-2的第一作者，Ralph S. Baric团队的重要人物Vineet D. Menachery（维内特·德梅纳赫里），他也是论文A-4（见下）的第三作者。  6park.com
2020年1月21日，新冠疫情发生不久，武汉病毒研究所抢先申报了一项专利《瑞德西韦抗2019新型冠状病毒的用途》，这是一项瑞德西韦用途专利，武汉所试图通过PCT(专利合作协定)途径将该专利从中国推及全球主要国家，使中国因此专利而受益。武汉病毒研究所凭什么判断瑞德西韦可能对治疗新冠病毒有效？因为新冠病毒出自他们之手吗？是他们未卜先知吗？当然都不是，原因很简单，因为他们知道Ralph S. Baric等人2017年6月发表的这篇论文，知道瑞德西韦的广谱抗冠状病毒功效。 6park.com
论文A-4 6park.com
2018年12月19日，Ralph S. Baric团队、国家过敏和传染病研究所（所长为安东尼·福奇）的两个下属机构（病毒学实验室、落基山兽医分会）在著名国际开源出版期刊MDPI（Multidisciplinary Digital Publishing Institute）联合发表了一篇论文： SARS-Like Coronavirus WIV1-CoV Does Not Replicate in Egyptian Fruit Bats（类SARS冠状病毒WIV1不会在埃及果蝠中复制）
https://www.mdpi.com/1999-4915/10/12/727/htm
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6316779/ 6park.com
注：埃及果蝠（Egyptian fruit bat，Rousettus aegyptiacus）是马尔堡病毒的天然宿主，也是所有丝状病毒的唯一已知宿主。 6park.com
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论文有以下要点：
1）WIV1病毒能有效利用埃及果福的ACE2进入果蝠细胞，感染果蝠的呼吸系统（鼻腔、肺）及胃、 肾脏和肠等器官，可观察到这些器官因感染而产生的明显的免疫反应；
注：新冠病毒也能感染人类的上述器官，WIV1与新冠的根本区别在于，WIV1的病毒骨架对人没有致病力，不会使人产生疾病症状。 6park.com

图示：WIV1感染使果蝠鼻甲（A）、气管（B）、肺（C）、肾（D）、胃（E）、肠（F）等器官、组织产生了不同程度、不同细节的免疫反应。
2）尽管WIV1可感染果蝠多处器官、组织，并引发免疫反应，但12只实验果蝠都没有表现出疾病迹象（如呼吸窘迫，厌食症或嗜睡），未检测到果蝠的体重减轻或体温变化。 6park.com
3）在不同的感染后时段对实验果福实施安乐死，对以下诸多器官、组织进行病毒学和组织病理学分析：鼻甲、喉、咽、气管、肺、脑、眼、结膜、心、肝、脾、肾、膀胱、生殖器官、胃、近端和远端肠道、颈部淋巴结、肾上腺、皮肤和骨骼肌。 
注：这表明，Ralph S. Baric团队认识到了WIV1病毒的泛器官、组织感染能力，新冠病毒也具有泛器官、组织感染能力。 6park.com
4）感染后第三天，仅在果蝠咽部和鼻甲骨检测到了WIV1病毒的RNA，在其它各器官、组织中均未再检测到WIV1病毒的RNA（WIV1病毒感染了这些器官、组织，但在感染后，因为缺乏有效的持续复制、繁衍，它又从这些器官、组织中消失了）。 6park.com

感染后第3天果蝠各器官、组织WIV病毒RNA载量统计图
5）实验表明，WIV1不会对果蝠造成强烈感染，不能引发可观察的临床症状；论文判断：WIV1在果蝠中可能只发生了一些低水平的病毒复制。 6park.com
6）为对照WIV1的细胞感染能力，分别用SARS的刺突蛋白、MERS的刺突蛋白与VSV病毒的骨架，基于它们的基因序列，使用反向遗传平台合成了二种嵌合假病毒SARS-S、MERS-S；研究中使用的WIV1病毒毒株也是使用反向遗传平台，基于WIV1的基因序列人工合成、收获的。
注：VSV病毒，即vesicular stomatitis virus，水疱性口炎病毒。 6park.com
7）使用三种转基因BHK细胞进行体外实验：表达人类ACE2的BHK细胞，表达埃及果福ACE2的BHK细胞，表达人类DPP4的BHK细胞。实验证明，WIV1及SARS-S都能感染前二种转基因BHK细胞，在感染后48小时能检测到细胞培养物中的病毒复制；而MERS-S则能感染表达DPP4的BHK细胞。实现结果见下图。
注：
BHK细胞，即Baby Hamster Syrian Kidney cells，叙利亚幼仓鼠肾细胞；
DPP4，即dipeptidyl peptidase IV，二肽基肽酶4，也称为CD26或腺苷脱氨酶复合蛋白-2，是一种丝氨酸外肽酶，调节多种肽（如生长因子、趋化因子和神经肽）的生物活性，在葡萄糖代谢中起主要作用。和ACE2一样，DPP4也是一种跨（细胞）膜糖蛋白，它是MERS病毒（中东呼吸综合症病毒）感染细胞时使用的受体。 6park.com
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图C：WIV1、SARS-S、MERS-S对四种BHK细胞的感染能力，每种BHK细胞培养物一式三份。
横坐标为四种BHK细胞：表达人类DPP4的BHK细胞、表达人类ACE2的BHK细胞、表达果蝠ACE2的BHK细胞、没有ACE2的BHK细胞；纵坐标为病毒复制滴度的对数值；
图C表明：WIV1、SARS-S可感染表达人或果蝠ACE2的转基因BHK细胞；MERS-S可感染表达人DPP4的转基因BHK细胞。
图D：WIV1对三种BHK细胞（表达人ACE2、表达果蝠ACE2，无ACE2）的感染情况，感染后0小时、48小时TCID（Tissue Culture Infective Dose，组织培养感染剂量）的对数值。图D亦说明，WIV1能有效感染两种转基因BHK细胞，并在感染后健壮复制。 6park.com
Ralph S. Baric团队不仅对WIV1（rs3367）病毒做过反复、深入的研究，而且对另一纽带--冠状病毒刺突蛋白的关键氨基酸也做过极其频繁、极其深入、极其细致的研究。 6park.com
（未完待续）

贴主:hgao于2024_03_26 13:31:43编辑