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新冠病毒源自何处谁设计制造了新冠病毒?

送交者: 冷猫居士[♂★★猫帅★★♂] 于 2021-09-25 18:18 已读 860 次  

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新冠病毒源自何处,谁设计、制造了新冠病毒? 6park.com


本文是 “Ralph S. Baric的病毒改造与人工合成”系列文章的第二篇,接续:
Ralph S. Baric的病毒改造与人工合成(序篇)
https://club.6parkbbs.com/chan2/index.php?app=forum&act=threadview&tid=13522147 6park.com


Ralph S. Baric(拉尔夫·巴里克),北卡罗来纳大学教堂山分校教授,反向遗传平台的发明者,无痕迹病毒改造技术的发明者,国际顶级病毒学权威,国际顶级功能增益研究权威,病毒功能增益性改造的热衷力行、狂热痴迷者。 6park.com


Ralph S. Baric(团队)与新冠病毒存在多项、多组关联关系。新冠病毒的多处特殊结构,新冠病毒具有的多项特殊功能、特性,Ralph S. Baric(团队)都专门研究过,甚至反复研究过,或研究过高度相关的内容;不仅如此,Ralph S. Baric(团队)在不同论文中对冠状病毒改造方向,对未来可能出现的冠状病毒的特性,做过多项预测和展望,其中至少四项,在新冠病毒身上已经神奇地应验(、实现)了。 6park.com


在Ralph S. Baric(团队)与新冠病毒的多组、多项关联关系中,存在一组双纽带关联,这组关联的双纽带指:
纽带一--蝙蝠冠状病毒WIV1(rs3367),已知的自然界中跨物种感染能力最强的冠状病毒。
纽带二--关键氨基酸,即冠状病毒刺突蛋白RBD(Receptor Binding Domain,受体结合域)的5个特殊氨基酸,它们决定冠状病毒的刺突蛋白能否结合脊椎动物的ACE2受体,决定冠状病毒能否进入(感染)某个物种的细胞,决定冠状病毒的宿主范围。 6park.com


本文将通过以下六个部分展开。
I、WIV1(Rs3367)病毒
II、新冠、WIV1(rs3367)高度相似的强大跨物种感染能力、高度相似的宿主范围
III、冠状病毒刺突蛋白RBD的5个关键氨基酸
IV、新冠、WIV1(rs3367)关键氨基酸的高度关联性、高度等价性
V、Ralph S. Baric团队对WIV1(rs3367)的研究
VI、Ralph S. Baric团队对关键氨基酸的研究 6park.com


为帮助理解本文有关内容,插贴一张冠状病毒结构示意图。 6park.com


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首先详细介绍一下WIV1(Rs3367)病毒。 6park.com


I、 WIV1(Rs3367)病毒 6park.com


rs3367、WIV1,是一对“孪生”蝙蝠冠状病毒。 6park.com


rs3367,分离、分析自中华菊头蝠(又称中华马蹄蝠)的肠道与粪便样本(应该是分析出了基因序列,但没有获得有活性的病毒毒株),样本收集地点是距云南昆明约60公里的一处多种蝙蝠混居的洞穴,收集时间是2012年3月。rs3367的全基因组序列于2013年4月8日上传到NCBI(National Center for Biotechnology Information,美国国家生物技术信息中心) GenBank生物信息数据库,实现了国际共享,其GenBank(ACCESSION) ID为: KC881006。 6park.com


为什么要强调基因序列的国际共享呢?因为对于病毒研究,包括病毒改造来说,最不可或缺的不是病毒毒株,而是基因序列。即使没有现成的病毒毒株,只要有基因序列,就可以在实验室中合成、克隆出病毒毒株。 6park.com


不晚于2003年,科学家已开发出一种反向遗传平台,该平台能基于病毒的基因序列,方便、快捷、精准地合成、收获病毒的活性毒株。反向遗传平台的核心发明者就是Ralph S. Baric。 6park.com


2003年10月28日,Ralph S. Baric团队、美国陆军传染病医学研究院、范德堡大学医疗中心联合于PNAS(美国国家科学院院刊)发表论文:Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS病毒全长传染性cDNA的反向遗传学)。
https://www.pnas.org/content/100/22/12995 6park.com



Ralph S. Baric是该论文的通讯作者。论文宣告了反向遗传(克隆)平台的问世,在论文中,Ralph S. Baric等人使用该平台,基于SARS病毒的基因序列,首先合成了SARS病毒的cDNA(complementary DNA,互补DNA,RNA的DNA复制品),接着由cDNA转录出SARS的RNA,而后将SARS的RNA通过电穿孔释放到Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞系细胞)中,最终成功收获了SARS RNA在Vero E6细胞中组装出的具有生物活性(感染、复制能力)的SARS病毒克隆毒株。也就是说,使用反向遗传平台合成的第一种病毒,就是SARS病毒;Ralph S. Baric等人在SARS疫情发生的次年,就能人工合成SARS病毒的RNA并收获SARS病毒的活性毒株。 6park.com


经常有人说,Ralph S. Baric(团队)没有蝙蝠冠状病毒的毒株,不可能基于蝙蝠冠状病毒进行病毒改造,不可能将蝙蝠冠状病毒改造为新冠病毒;武汉病毒研究所是多种蝙蝠冠状病毒毒株的发现和唯一拥有者,因此,将蝙蝠冠状病毒改造为新冠病毒的,是武汉病毒研究所。 6park.com


上述说法有两个错误。第一,石正丽团队发现、分离的蝙蝠冠状病毒毒株或病毒样本,不只收藏于武汉病毒研究所病毒库,它们还要提供给直接合作者(PREDICT项目)、直接资助者--达萨克为主席(首席执行官)的生态健康联盟。达萨克为谁工作?为美国政府工作,生态健康联盟背后的老板、金主是美国国际开发署(USAID)和美国国立卫生研究院(NIH),将病毒毒株或病毒样本提供给生态健康联盟,就是将它们提供给美国。 6park.com


第二,自2003年开发出反向遗传平台后,Ralph S. Baric团队就不再依赖源自自然界的病毒毒株了,他们可以基于基因序列,使用反向遗传平台自行合成所需的病毒毒株的克隆,并使用所合成的病毒毒株进行病毒研究或病毒改造。 6park.com


反向遗传平台不仅可合成已有病毒的克隆毒株。对病毒的基因序列进行改造设计后,基于改造后的基因序列,使用反向遗传平台同样可以合成出新病毒的病毒毒株。反向遗传平台实际上提供了一种无痕迹改造病毒的技术。 6park.com


2004年后,Ralph S. Baric(团队)在论文中使用的病毒,几乎都是使用反向遗传平台人工合成的;Ralph S. Baric(团队)在“无数篇”论文中,“无数次”地使用反向遗传平台合成已有病毒毒株及改造病毒的毒株。我以前的文章已经提供过一些实例,本系列后续文章将展示更多的实例
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石正丽团队什么时候研发出了反向遗传平台?在2016年6月24日发表的一篇Journal of Virology论文中(署名作者包括达萨克),石正丽团队宣布研发出了自己的反向遗传系统,并首次应用该系统合成了三种病毒,其中之一是论文的研究对象WIV1。该论文为:Bat Severe Acute Respiratory Syndrome-Like Coronavirus WIV1 Encodes an Extra Accessory Protein, ORFX, Involved in Modulation of the Host Immune Response(蝙蝠类SARS冠状病毒WIV1编码一种额外的辅助蛋白ORFX,参与宿主免疫反应的调节)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4936131/
https://journals.asm.org/doi/10.1128/JVI.03079-15 6park.com


注:这不是一篇功能增益研究论文,该论文未对WIV1进行功能增益性改造;论文记录表明,石正丽团队未发表过任何功能增益研究论文,未对任何病毒进行过功能增益性改造,未改造出过任何一种有人类致病能力的病毒。 6park.com


石正丽团队研发出反向遗传系统(平台)的时间,比Ralph S. Baric团队晚了13年! 6park.com


言归原题。 6park.com


WIV1病毒也分离自中华菊头蝠(中华马蹄蝠)的肠道与粪便样本(WIV1既有基因序列,又有分离或培养出的有活性的病毒毒株),其样本与rs3367来自同一蝙蝠洞穴,收集时间是2012年9月。2013年4月8日,WIV1的刺突蛋白(Spike蛋白,S蛋白)基因序列上传至GenBank,实现了国际共享(同一天,石正丽团队还上传了rs3367、rsSHC014的全基因组序列),其GenBank ID为:KC881007;2013年7月8日,WIV1全基因组序列上传至GenBank,实现了国际共享,其GenBank ID为:KF367457。在某些论文中,WIV1也称为WIV1-CoV或SL-CoV-WIV1。 6park.com


WIV1与rs3367是一对“孪生”病毒,它们极度相似。二者全基因组序列的同一性或相似度为99.92% ;在决定物种感染能力及宿主范围的S蛋白S1亚基部分,二者氨基酸序列同一性为100%。在不同论文中,有时使用rs3367,有时则使用WIV1,它们可以相互替代,不会对论文产生任何实质影响。为描述方便,我本人的文章经常将它们视为同一病毒。 6park.com


还有一对“孪生”蝙蝠冠状病毒:WIV16与Rs4874,二者全基因组序列同一性为99.93%。WIV1(rs3367)、WIV16(Rs4874)发现于云南同一蝙蝠洞穴,这两对“孪生”病毒之间也非常相似,WIV1与WIV16全基因组序列的一致性(相似度)为97.54%;值得一提的是,两对“孪生”病毒RBD的五个关键氨基酸完全相同,这意味着它们的ACE2结合能力,宿主细胞进入(感染)能力,宿主范围都高度相似。 6park.com



WIV1(rs3367)、WIV16(Rs4874)刺突蛋白RBD的五个关键氨基酸对照表。
WIV1 spike GenBank ID:AGZ48828,WIV16 spike GenBank ID:ALK02457。
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ACE2是什么大家都知道,容我再罗嗦一嘴。 6park.com


ACE2,即Angiotensin Converting Enzyme2,血管紧张素转换酶2,是细胞表面的一个跨膜糖蛋白,广泛存在于脊椎动物的呼吸、消化、血液、泌尿、生殖、视觉等系统的器官、组织内。ACE2可介导与之发生结合的病毒进入它所嵌附的细胞内部。ACE2也是肾素-血管紧张素系统(RAS)中的一个关键酶。 6park.com


WIV1、rs3367是非常特殊、非常奇特的蝙蝠冠状病毒。 6park.com


第一个特别之处是:它们能够进入(或者说感染)人体细胞。这是由于它们的刺突蛋白能够结合hACE2(human ACE2),通过这种结合,介导病毒进入(感染)人体细胞。 6park.com


绝大多数蝙蝠冠状病毒没有人体细胞进入(感染)能力,它们的刺突蛋白不能结合hACE2。 6park.com


已知的刺突蛋白可结合hACE2,具有人体细胞进入(感染)能力的特殊蝙蝠冠状病毒共(约)有7种,本文已提及其中4种:rs3367、WIV1、WIV16、rs4874,下一篇文章将涉及第5种:SHC014(即rsSHC014)病毒。 6park.com


WIV1、rs3367的第二个特别之处是:虽然能够进入(感染)人体细胞,但它们不会使人发病,不会使人体产生任何疾病症状。它们本身是人类无害的,但是,将它们的刺突蛋白的全部或部分嫁接、嵌合到有致病能力的病毒骨架上(如SARS),将能改造出新的有人类致病力的病毒,借鉴其刺突蛋白的结构改造某些病毒,也能改造出有人类致病力的病毒。 6park.com


还有第三个特别之处。。。 6park.com


II、 新冠、WIV1(rs3367)高度相似的强大跨物种感染能力,高度相似的宿主范围 6park.com


WIV1、rs3367的第三个特别之处是:它们具有强大的跨物种感染能力,它们的刺突蛋白能够结合众多物种的ACE2,因而,它们能够进入(感染)众多脊椎动物的细胞。在新冠病毒出现前,WIV1、rs3367是已知的跨物种感染能力最强的病毒(另一对孪生病毒WIV16、Rs4874的跨物种感染能力应该与WIV1、rs3367相当),已证实的可被它们感染的人类、动物有以下10种:
人类、果子狸、貉、非洲绿猴、恒河猴、雪貂、水鼬(水貂)、猫、蝙蝠、老鼠(能使实验小鼠产生轻度疾病症状)。 6park.com


WIV1、rs3367强大的跨物种感染能力使它们成为功能增益研究,冠状病毒功能增益改造的绝佳原材料、绝佳参照物。 6park.com


新冠病毒与WIV1、rs3367有什么可比照之处吗? 6park.com


新冠病毒的跨物种感染、传播能力与WIV1、rs3367高度相似,极为强大、惊人,已确认或已报告的可被新冠感染的动物包括:
人类、灵长类动物(如大猩猩、非洲绿猴、恒河猴、食蟹猕猴、狒狒、黑长尾猴和狨猴)、穿山甲、狗、某些鼠类(如仓鼠、田鼠)、鼬类或貂类(如雪貂、水貂、水獭、黄鼠狼等等)、北美鹿(如白尾鹿)、猫、老虎、雪豹、狮子、猪、兔子、貉、麝香猫、树鼩、果蝠等等。 6park.com


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新冠的感染名单看上去比WIV1(rs3367)长得多,这是否说明新冠的跨物种感染能力比WIV1(rs3367)强大得多?并非如此,这主要是研究、确认的不对等造成的,对WIV1、rs3367的物种感染能力所做的研究、确认远少于新冠;还有一个原因,WIV1、rs3367很少使被感染的动物发病或产生症状,不专门研究,很难发觉它们对某物种的感染能力。WIV1、rs3367可感染的动物绝不会只限于前述10种,我的推测是,WIV、rs3367的跨物种感染能力可能还稍胜新冠。 6park.com


WIV1(rs3367)已知的感染名单是:
人类、果子狸、貉、非洲绿猴、恒河猴、雪貂、水鼬(水貂)、猫、蝙蝠、老鼠。 6park.com


将这一名单与新冠的感染名单进行比对,不难发现,WIV1(rs3367)能感染的物种,几乎都包含在新冠病毒的感染名单中,唯一的例外是蝙蝠。WIV1(rs3367)能感染蝙蝠,特别是其原始宿主菊头蝠;新冠病毒能感染果蝠,但对众多蝙蝠冠状病毒的宿主菊头蝠,新冠的感染能力很弱(这是新冠来自蝙蝠的一个反证)。还要说明一下果子狸和麝香猫的情况,已知WIV1(rs3367)能感染果子狸,而新冠能感染麝香猫,果子狸和麝香猫同属灵猫科,它们的ACE2高度相似,可以推断,WIV1(rs3367)和新冠都能感染这两种动物。 6park.com


因此,可作出如下推断:新冠与WIV1(rs3367)的宿主范围高度雷同。 6park.com


新冠与WIV1(rs3367)的跨物种感染(、传播)能力高度相似,同样极为强大,这只是巧合吗?新冠与WIV1(rs3367)的宿主范围高度雷同,这又是巧合吗? 6park.com


都不是巧合,它们有着内在的结构原因。什么结构原因?新冠与WIV1(rs3367)的某一内在结构高度关联、高度等价。新冠的什么结构与WIV1(rs3367)高度关联、高度等价?就是决定ACE2结合能力,决定物种细胞进入能力,决定宿主范围的刺突蛋白RBD的5个关键氨基酸。 6park.com


III、 冠状病毒刺突蛋白RBD的5个关键氨基酸 6park.com


病毒能否感染细胞,取决于病毒是否有能打开细胞锁的钥匙。冠状病毒用于打开细胞锁的钥匙就是它的刺突蛋白(即Spike蛋白,S蛋白),而细胞的锁,就是嵌在细胞膜上的各种细胞受体,如ACE2,TMPRSS2(跨膜丝氨酸蛋白酶2),CD4(表面抗原分化簇4)等等。 6park.com


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冠状病毒的细胞钥匙--刺突蛋白包括相连的两个部分--两个亚基,最外部的是S1蛋白,S1蛋白与病毒包膜之间的是S2蛋白。S2蛋白也叫膜融合亚基(参与新冠病毒与细胞的膜融合),它相当于钥匙的手柄部分;S1蛋白也叫受体结合亚基,它负责与细胞表面的受体结合,相当于钥匙的齿面部分。S1蛋白中有一个区域叫做受体结合域(Receptor Binding Domain),简称RBD,RBD是S1蛋白与细胞受体发生接触的部分,它相当于齿面上的钥齿区域。 6park.com


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SARS病毒、新冠病毒感染细胞所用的受体都是ACE2(还有其它辅助受体)。冠状病毒刺突蛋白RBD中,与ACE2能发生直接接触的氨基酸(残基)有14个,这14个氨基酸中,有5个起决定性的作用,它们决定刺突蛋白能否与ACE2结合,进而决定冠状病毒能否进入(感染)细胞。这5个关键氨基酸对冠状病毒的宿主范围也起着最重要的决定作用,它们相当于冠状病毒刺突蛋白钥匙上的关键钥齿。 6park.com


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如果这5个氨基酸与ACE2适配,那么,刺突蛋白就能与ACE2成功结合,细胞的ACE2锁就“打开”了,冠状病毒将在ACE2的介导下,进入(感染)ACE2所嵌附的细胞,或在膜融合(病毒包膜与细胞膜融合)后直接向细胞内释放其RNA。 6park.com


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经过上述准备之后,现在可以解决、说明如下问题了:新冠的关键氨基酸,与WIV1(rs3367)的关键氨基酸之间,到底存在着怎样的高度关联? 6park.com


IV、 新冠、WIV1(rs3367)关键氨基酸的高度关联、高度等价性 6park.com


下表展示了新冠、rs3367(WIV1)5个关键氨基酸的对应关系。氨基酸名称、字母缩写后括号内的数字代表该氨基酸在刺突蛋白氨基酸序列中的序号。如,第二行第二列的亮胺酸L(455),代表新冠病毒的第一个关键氨基酸--亮胺酸(字母缩写为L),是新冠刺突蛋白氨基酸序列中的第455个氨基酸(残基)。 6park.com



注:新冠病毒刺突蛋白的“长度”有两种情况:一类毒株的刺突蛋白包含1273个氨基酸(残基),另一类则包含1269个氨基酸(残基)。上图对应第一种情况;如果采用后一类毒株,那么表中第二行各氨基酸括号内的序号都要-4,其它内容不受影响。 6park.com


由图可见,新冠、rs3367(WIV1)的5个关键氨基酸有三个是一样的:
它们的第五、第四、第二关键氨基酸同为酪氨酸Y、天门冬酰胺N、苯丙胺酸F。 6park.com


新冠的第三关键氨基酸是麸酰胺酸Q,rs3367(WIV1)的第三关键氨基酸是天门冬酰胺N。这两个氨基酸是不是没什么关系?不,它们大有关联,二者的多项理化属性恰好非常相似或接近,这意味着,它们在刺突蛋白与ACE2结合时所起的作用是高度等价或等效的。 6park.com



至此可知,新冠的5个关键氨基酸,与WIV1(rs3367)的5个关键氨基酸高度关联:三个雷同,一个高度等价。 6park.com


新冠病毒可能是rs3367(WIV1)自然演化产生的吗?这是不可能的,它们全基因组序列的一致性(相似度)仅为82.13%,而且,它们之间存在着众多自然演化难以逾越的重大结构差异。 6park.com


这是其它冠状病毒自然演化为新冠病毒时发生的巧合吗?新冠病毒为什么有层出不穷的巧合? 6park.com


上述高度关联性明显是人为设计的结果:有人参照WIV1(rs3367)的5个关键氨基酸,通过重用和等效或等价替代,设计出了新冠病毒的5个关键氨基酸。由于这一人为设计的新冠病毒的关键氨基酸,与WIV1(rs3367)的关键氨基酸高度等价或等效,所以导致了如下两种结果:
1)新冠的跨物种感染、传播能力与WIV1(rs3367)高度相似、极为强大;
2)新冠与WIV1(rs3367)的宿主范围高度雷同。 6park.com


参照WIV1(rs3367)设计新冠病毒5个关键氨基酸算不上很高难度的设计工作,不计摸索过程及实验细节的话,通过以下三个步骤即可完成:
1)复用WIV1(rs3367)5个关键氨基酸中的3个:第五关键氨基酸--酪氨酸Y,第四关键氨基酸--天门冬酰胺N,第二关键氨基酸--苯丙胺酸F;
2)挑选WIV1(rs3367)第三关键氨基酸--天门冬酰胺N的替代品,找到了与之理化属性非常相似、接近的麸酰胺酸Q,以其为新冠的第三关键氨基酸;
3)最后挑选新冠的第一关键氨基酸。挑选原则是:入选者应与前四个已确定的关键氨基酸最配套,使新冠5个关键氨基酸与WIV1(rs3367)的5个关键氨基酸整体上高度同构或在与ACE2结合时高度等价、等效。通过软件结构模拟、ACE2结合模拟,或实际的ACE2结合实验,在20种常见氨基酸中,选出了亮氨酸L,以其为新冠的第一关键氨基酸。
新冠关键氨基酸设计结束。 6park.com


谁参照WIV1(rs3367),通过氨基酸重用+替代,设计出了新冠病毒的5个关键氨基酸? 6park.com


有没有人同时深入研究过WIV1(rs3367)和关键氨基酸? 6park.com


有,有人同时符合以下四个条件:
1)反复、深入研究过WIV1(rs3367);
2)“无数次”研究过冠状病毒刺突蛋白RBD的关键氨基酸;
3)有着丰富的功能增益研究、病毒功能增益改造经验;
4)以WIV1(rs3367)为原材料做过功能增益研究,改造出了有人类致病能力的危险病毒。 6park.com


这个人是谁?Ralph S. Baric。Ralph S. Baric(团队)不仅同时符合以上四个条件,而且极可能是唯一同时符合以上四个条件的人(或团队)。

送交者: 苦难与荣耀[☆★★声望品衔11★★☆] 于 2021-09-24 21:48  6park.com
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