接续：谁设计、制造了新冠病毒（二 中）
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本文介绍其余四篇furin酶切位点插入相关的病毒改造论文。
论文五
2008年9月10日，日本国立传染病研究所的一组科学家在Journal of Virology上在线发表了如下论文：
Entry from the Cell Surface of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus with Cleaved S Protein as Revealed by Pseudotype Virus Bearing Cleaved S Protein
带有裂解S蛋白的假病毒揭示了带有裂解S蛋白的SARS病毒的细胞表面进入（机制） 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2583654/
论文相关要点如下：
1、通过重叠PCR方法（基因改造、基因定点突变的最基本技术），将SARS病毒S蛋白第797~801氨基酸（残基）由“KPTKR”替换为“KRRKR”，构建了S蛋白的人工切割突变体cl-S（cleavage-S）。引入的五氨基酸组合“KRRKR”中包含基本furin酶切组合“RRKR”。见下图：

SARS（wild-type）S蛋白wt-S ，及其人工切割改造体cl-S结构示意图
SARS病毒S蛋白S1亚基的最后一个氨基酸是R667（S蛋白的第667氨基酸R，R代表精氨酸R），在S蛋白第797氨基酸~801氨基酸之间设计、引入“KRRKR”或“RRKR”furin酶切位点位于S2亚基内，它将导致cl-S从第801氨基酸R801处被furin蛋白酶水解切割为两部分（furin蛋白酶水解切割的位点是“RXXR”组合尾部的精氨酸R）。
2、将cl-S 、wt-S分别转染入HeLa细胞和HeLa-ACE2细胞（即将两种S蛋白的cDNA添加到细胞DNA中，使细胞DNA含有S蛋白基因），将细胞培养物孵育48 小时后发现：
a) cl-S 转染的HeLa-ACE2细胞在不添加胰蛋白酶的情况下便可形成大的合胞体，而wt-S转染的HeLa-ACE2细胞在不添加胰蛋白酶时不会形成合胞体；
注：cl-S可被细胞中广泛存在的furin蛋白酶水解切割，其S2亚基的病毒-细胞，细胞-细胞膜融合能力因此被激活。
b) 如果在细胞培养基中添加胰蛋白酶（trypsin），那么wt-S 转染的HeLa-ACE2细胞也能形成合胞体；
注：SARS病毒S蛋白S1亚基的最后一个氨基酸R667是一个胰蛋白酶切位点，胰蛋白酶的水解切割也能激活S2亚基的病毒-细胞及细胞-细胞膜融合能力。
胰蛋白酶通常只存在于哺乳动物的小肠中，在其它细胞环境中并不存在；furin蛋白酶则在脊椎动物的各种器官、组织中广泛存在，无须人为添加。
c) 无论是否添加胰蛋白酶，cl-S 或wt-S转染的HeLa细胞（不含ACE2基因的Hela细胞）都不能形成合胞体（这表明，S1亚基与ACE2受体的结合是激活S2亚基膜融合能力，形成合胞体的先决条件）。
3、使用抗S2 兔血清进行蛋白质印迹分析，发现：
a) 在cl-S转染的HeLa-ACE2细胞培养物中检测到了分子量约为70 kDa的蛋白（它应是furin蛋白酶从R801处水解切割产生的S2亚基片段），在wt-S转染的HeLa-ACE2细胞培养物中没有检测到这一片断；
注：Da（Dalton，道尔顿）是分子质量单位，1Da=一个12C（碳12）原子质量的1/12；蛋白是大分子，其质量通常以kDa为单位（1kDa=1000Da）；
完整的未切割的SARS病毒S蛋白的分子质量约为240kDa，S蛋白S1亚基的分子质量约为150kDa，S2亚基的分子质量约为100kDa。
b) 在添加胰蛋白酶的情况下，cl-S和wl-S转染的HeLa-ACE2细胞培养物中都检测到了分子量约为100kDa的蛋白（它应是胰蛋白酶从R667处水解切割产生的完整的S2亚基）。
c) cl-S转染的不表达ACE2 的HeLa 细胞中未检测到切割产物，也没有检测到细胞间融合。
2、3两组实验的结果如下图：

在细胞中转染表达的cl-S 和wt-S 的融合能力和可切割性
2、3两组实验表明： 
a) S蛋白R801、R667两个位点的蛋白酶（furin蛋白酶或胰蛋白酶）水解切割都能有效促成细胞-细胞融合形成合胞体（合胞体也称多核扩大细胞或巨细胞）；
b) （对SARS S蛋白而言）ACE2 对诱导细胞间融合是必不可少的。
4、分别用wt-S、cl-S与VSV病毒（Vesicular Stomatitis Virus，水疱性口炎病毒）骨架嵌合，替代VSV的G蛋白，制作了两种假病毒VSV/wt-S和VSV/cl-S。
VSV是弹状病毒科（Rhabdoviridae）、水疱病毒属（Vesiculovirus）的成员，病毒粒子为子弹状或圆柱状，它具有结构相对简单、复制能力较强、发病过程快速、毒性、危险性低等特点，被广泛用于研究RNA进化和制作假病毒。
G蛋白是VSV的囊膜糖蛋白，它的部分角色、功能相当于冠状病毒的S蛋白。
下图示意了将冠状病毒的S蛋白嫁接到VSV病毒骨架上，替换掉其G蛋白制作假病毒的过程：

用VSV病毒、新冠S蛋白嵌合制作VSV-S假病毒示意图
5、研究溶酶体抑制剂Baf（Bafilomycin，巴弗洛霉素）对病毒感染能力的影响。实验证明：
baf使VSV/wt-S 对HeLa-ACE2 细胞的感染减少了90% 以上，但它只抑制了60%的VSV/cl-S 感染。研究者指出，他们制作的VSV/cl-S假病毒不纯净，其中混有相当数量的VSV/wt-S，baf对VSV/cl-S感染的抑制作用应该非常轻微。
由这一实验结果可知，VSV/wt-S对HeLa-ACE2 细胞的感染严重依赖于溶酶体；而VSV/cl-S对HeLa-ACE2 细胞的感染则不依赖于溶酶体。
注：SARS病毒及带有wl-S的VSV假病毒是通过内体途径感染细胞的，病毒被内吞进入细胞后包裹在内体囊泡中，需要在内体中，或从内体运输到溶酶体后，由溶酶体释放的组织蛋白酶L对其S蛋白进行水解切割，激活S2亚基的膜融合能力，使病毒包膜与内体（囊泡）膜或溶酶体膜发生膜融合，并在膜融合后向细胞开放环境中释放病毒包膜内的RNA（脱壳），完成感染过程，开始病毒复制。
VSV/cl-S有furin酶切位点，它可以被细胞内外广泛存在的furin蛋白酶水解切割，而不必依赖于细胞内的溶酶体释放的组织蛋白酶L的水解切割。如果cl-S的furin水解切割发生在细胞表面（完成受体结合后），那么VSV/cl-S的病毒包膜可直接与细胞膜融合，并在二膜融合后立即向细胞内释放RNA，第一时间开始病毒复制。这与新冠病毒的感染途径是相同的，直接与细胞膜融合释放RNA是最高效的感染方式，其效率是内吞方式的100~1000倍。再展示一下（直接）膜融合感染与内吞感染的对照图：

新冠、SARS细胞感染生命周期（侵入、脱壳、复制、扩散）对照图
6、研究几种蛋白酶抑制剂对感染的影响。实验证明，VSV/wt-S对HeLa-ACE2细胞的感染被三种CPL（cathepsin L，组织蛋白酶L）抑制剂MDL、EST和leupeptin严重阻断，而VSV/cl-S的感染只被部分抑制。这进一步表明，VSV/wt-S的感染高度依赖CPL，而 VSV/cl-S的感染则不依赖CPL。
5、6两组实验结果如下图：

溶酶体抑制剂或组织蛋白酶抑制剂对病毒感染能力的影响
图中，白色条柱对应G蛋白未被替换的VSV病毒，灰色条柱对应VSV/cl-S，黑色条柱对应VSV/wt-S；
VSV病毒或假病毒中都插入了GFP（Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）基因，并以GFP基因阳性细胞的数量来评估感染能力。以G蛋白未被替换的VSV病毒在未加抑制剂的情况下的感染能力为100%对照标准。
关于所使用的几种抑制剂：
Baf是溶酶体抑制剂，可视为间接的CPL（组织蛋白酶L）抑制剂，CPL是溶酶体释放的。
CA-074是组织蛋白酶B抑制剂；
EST、MDL是组织蛋白酶L抑制剂；
Leupeptin 是丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂。半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、H、L等，这意味着，Leupeptin同时是组织蛋白酶B、H、L的抑制剂。
还有一点要注意，如论文所述，VSV/cl-S中混有相当比例的VSV/wt-S，因此，VSV/cl-S感染的受抑制程度应该比结果图显示的情况轻得多。
论文指出，以上实验结果（5、6两组）共同表明：VSV/cl-S可以绕过内体途径感染细胞，论文推断，VSV/cl-S最有可能从细胞表面直接进入靶细胞（即指通过病毒包膜与细胞膜的膜融合直接从细胞表面向细胞内释放病毒RNA）。
7、为了进一步证实VSV/cl-S 可直接从细胞表面进入，研究者联合使用了溶酶体抑制剂Baf及一种七肽重复肽HRP(heptad repeat peptide)，后者（HRP）被证明（2007年10月的一篇论文）可以有效阻止 SARS病毒从细胞表面感染（指有外源性胰蛋白酶存在时，SARS病毒也可通过直接膜融合方式感染细胞），但不能阻止SARS病毒通过内体途径感染。
在这组实验中，Baf是内体途径感染抑制剂，HRP是（细胞表面）直接膜融合途径感染抑制剂。
实验表明：
a) 只使用Baf时，与之前的实验结果相同，VSV/wt-S对HeLa-ACE2细胞的感染被高度阻止，VSV/cl-S则保持了约40%的感染能力（其中可能混有60%的VSV/wt-S）；
b) 只使用HRP时，VSV/wt-S的感染能力几乎不受影响，VSV/cl-S则保持了约60%的感染能力（可能是其中混有的60%的VSV/wt-S造成的感染）；
c) 当同时使用Baf和HRP时，不仅 VSV/wt-S的感染被高度阻止，而且VSV/cl-S的感染能力也几乎尽失（VSV/cl-S的感染及其中混有的VSV/wt-S的感染都被强力阻断）。
实验结果见下图：

Baf、HRP对VSV/cl-S、VSV/wt-S感染能力的影响
这表明：VSV/cl-S的细胞感染途径，就是被HRP阻止的细胞表面直接感染途径（病毒包膜在细胞表面与细胞膜直接融合并释放病毒RNA）。
假病毒实验结果预示着，拥有cl-S中furin酶切位点的SARS病毒变异体的感染途径将与VSV/cl-S相同：不通过内吞，无须等到内吞后再与内体膜或溶酶体膜融合以释放RNA，它的病毒包膜将在细胞表面与细胞膜直接融合，第一时间向细胞内释放RNA。
具有cl-S中furin酶切位点的VSV/cl-S或SARS病毒变异体的感染方式就是新冠病毒的感染方式。
论文六
2009年3月24日，Cornell大学（康奈尔大学）兽医学院微生物学与免疫学系的加里·惠特克(Gary R. Whittaker)领导的一个三人小组在PNAS（美国国家科学院院刊）上发表了如下论文：
Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites
经由两个不同位点的连续蛋白水解切割（引发）的SARS 病毒刺突蛋白激活
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2660061/
https://www.pnas.org/content/106/14/5871
该研究在SARS病毒刺突蛋白中设计、引入了两个furin酶切位点，其一在S1/S2处（R667处），其二在S2亚基内，S蛋白的第793~797氨基酸之间（与论文五的插入位置非常接近，这一位点通常称为S2'）。
S1/S2处的具体改造是，将SLLR之后的S蛋白第668~671氨基酸“STSQ”替换为“RSRR”，构建出了一个复合furin酶切组合“RRSRR”（与论文三SLLR变异体的构建非常相似）。改造前后的序列情况如下：


S1/S2处的序列改造情况
S2'处的的具体改造是，将S蛋白的第794~797氨基酸“PTKR”替换为“RTKR”（实际上只替换了一个氨基酸，把第794氨基酸由脯氨酸P替换为精氨酸R），构建了一个基本furin酶切组合“RTKR”。改造前后的序列情况如下：


S2'处的序列改造情况
基于以上两处改造，构建了三个SARS病毒S蛋白的人工变异（改造）体：SARS-Fur667、SARS-Fur797、SARS-Fur667-797。其中，SARS-Fur667和SARS-Fur797 各含一处改造，各具有一个furin酶切位点，SARS-Fur667-797同时包含二处改造，兼具两个furin酶切位点。
实验证明：
1、S1/S2处构建的furin酶切位点可使S蛋白被有效水解切割，裂解为分离的S1、S2亚基；
2、S1/S2处构建的furin酶切位点明显增强了细胞-细胞融合，促进了合胞体的生成；
3、S1/S2处构建的furin酶切位点明显提高了SARS病毒的非内体途径感染效率。当在细胞培养物中添加了外源性胰蛋白酶时，带有SARS S蛋白及（S蛋白）变异体SARS-Fur667的MLV（Murine Leukemia Virus，鼠白血病病毒）假病毒均可直接膜融合感染细胞，而且后者的感染效率显著高于前者（216%±78%）；
4、相比S1/S2位点，S2′处构建的furin酶切位点（对应变异体SARS-Fur797）的细胞-细胞融合、促成合胞体能力更为显著；
5、兼具两个furin酶切位点的变异体SARS-Fur667-797可导致超过95%的培养细胞发生细胞-细胞融合，形成非常大的合胞体。

SARS S蛋白（wt）及三种改造体细胞-细胞融合能力对照图
论文七
2014年11月6日，荷兰乌得勒支大学、莱顿大学、鹿特丹伊拉斯姆斯大学，瑞士苏黎世大学、美国爱荷华大学的一组科学家在国际著名病原微生物学术期刊PLoS Pathogens上在线发表了如下论文：
Coronavirus Cell Entry Occurs through the Endo-_Lysosomal Pathway in a Proteolysis-Dependent Manner
冠状病毒以依赖蛋白水解的方式通过内体/溶酶体途径达成细胞进入
https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1004502
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4223067/
论文涉猎广泛，内容博大，它对比研究了MHV-A59（鼠肝炎病毒A59株系）、FIPV（猫传染性腹膜炎病毒）、MERS-CoV（中东呼吸综合症冠状病毒）、VSV（水疱性口炎病毒）、IAV（A型流感病毒）等等众多冠状病毒的细胞进入、感染途径；它同时研究、考察了基因沉默（抑制、干扰特定的细胞基因），种种抑制剂、干扰剂（如RNA合成抑制剂、蛋白酶体抑制剂、内体成熟抑制剂、网格蛋白内吞介导抑制剂、肌动蛋白和巨胞饮作用影响剂、肌动蛋白细胞骨架改变剂、微管解聚诱导剂、胆固醇转运影响剂等等）、内体PH值等五花八门的各种因素对各病毒细胞进入、感染的影响。
在研究MHV-A59的感染方式时，论文在其S蛋白S2亚基融合肽（FP，fusion peptide）上游通过引入复合furin酶切组合，构建了一个MHV-A59的改造体MHV-S2‘FCS。具体改造是，通过定点诱变（site-directed mutagenesis），将S蛋白的第865~ 869氨基酸“AIRGR”替换为“RRRRR”。见下图A子图：

MHV-A59改造体MHV-S2‘FCS的构建及CPI对病毒感染的影响
图中的MHV-EFLM是在E蛋白（Envelope protein，包膜蛋白）和M蛋白（Membrane protein，脂质膜蛋白）之间加入了FL（firefly luciferase，萤火虫荧光素酶）基因的MHV-A59；MHV-S2‘FCS因继承了MHV-A59 S1/S2处原有的Furn酶切位点“RRAHR”而拥有两个furin酶切位点。
实验证明：
1、MHV-A59的感染能力取决于溶酶体蛋白酶对其S蛋白的水解加工（以激活S2亚基的膜融合能力，使病毒包膜与内体膜或溶酶体膜发生膜融合，并在膜融合之后向细胞中释放RNA）。
2、当向Hela细胞中添加泛溶酶体蛋白酶抑制剂CPI时，MHV-A59的感染受到严重抑制。见上图B子图（以MHV -A59在不加CPI时的感染情况为100%对照标准）。
3、具有融合肽上游的弗林蛋白酶切割位点“RRRRR”的MHV-S2‘FCS不再需要从内体运输到溶酶体，同时不再需要溶酶体蛋白酶对其S蛋白进行水解加工（它可在内体囊泡中先行被广泛存在的furin蛋白酶水解加工），MHV-S2‘FCS的感染能力不受泛溶酶体蛋白酶抑制剂CPI的影响。见上图B子图。
4、添加furin蛋白酶抑制剂FI（furin inhibitor）显著抑制了MHV-S2‘FCS对单倍体细胞HAP1的感染，当HAP1中缺乏VPS33A时，这种抑制作用更是表现得极为突出。见下图：

FI可显著抑制MHV-S2'FCS 的感染并增加其对内体~溶酶体成熟的依赖性。
注：
CPI：cysteine proteinase inhibitor，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，亦称胱抑素C，是一种泛溶酶体抑制剂。
HOPS ：homotypic fusion and vacuole protein sorting，同型融合和液泡蛋白分选，一种细胞中的蛋白复合体，参与晚期内体到溶酶体的成熟。
VPS33A，是HOPS一个重要亚基。
HAP1是一种近单倍体细胞系，它象永生的癌细胞系那样可以无限期分裂，并且几乎每个细胞都只有一个染色体拷贝。
H1-ΔV33是敲除了VPS33A亚基基因的HAP1细胞。
H1-ΔV33-fV33是先敲除VPS33A基因，再添加带有FLAG的VPS33A基因得到的HAP1细胞。
5、MHV-S2'FCS仍然是通过内吞途径感染细胞的，但其病毒包膜与内体囊泡膜的膜融合发生在早期内体阶段（膜融合后病毒RNA得以脱壳释放到细胞开放环境中开始病毒复制）；相比之下，MHV-A59的膜融合及RNA脱壳则发生在晚期内体阶段或溶酶体中（内体运输到溶酶体或内体与溶酶体结合）。MHV-S2'FCS的感染效率显著高于MHV-A59。
论文其它内容我就不赘述了，用论文的一个概括性配图来结束对该论文的介绍：

冠状病毒内吞感染的早期融合与晚期融合模型
论文八
中国科学家也做过furin酶切位点插入研究、实验。下面是我找到的唯一一个例子，一个很晚的例子。
2019年10月22日，中国农业大学兽医学院，农业部动物流行病学重点实验室的一组学者在MDPI（Multidisciplinary Digital Publishing Institut，多学科数字出版机构）旗下的Viruses月刊在线发表了如下论文：
The S2 Subunit of QX-type Infectious Bronchitis Coronavirus Spike Protein Is an Essential Determinant of Neurotropism
QX型传染性支气管炎冠状病毒刺突蛋白的S2亚基是嗜神经性的基本决定因素
https://www.mdpi.com/1999-4915/11/10/972
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6832359/
该研究的核心实验结论是：
在S2' 处引入furin酶切位点获得的重组QX基因型（QX型）传染性支气管炎病毒(IBV)导致更强的致病性、明显的神经症状和嗜神经性，它能破坏血脑屏障，诱发严重的脑炎并导致更高的死亡率。
传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis virus，IBV）是一种γ谱系（丙型冠状病毒属）冠状病毒（新冠、SARS、MERS是β谱系，即乙型冠状病毒属冠状病毒），发现于1930年，是最早发现的冠状病毒。
IBV能引发家禽的传染性支气管炎，鸡是IBV的最主要感染对象；IBV的侵害部位包括（鸡）的呼吸道、生殖道（如输卵管），以及肾脏、肠道、腺胃（前胃）等众多内脏器官，并可在内脏器官中持续存在160天；IBV的感染致死率约为15%~30%，小于10日龄的雌性雏鸡感染IBV往往导致永久性输卵管损坏。
IBV包括数百个血清型或毒株型，QX（Qingdao Xianwei）型IBV是IBV的一个腺胃型分支，最早发现、分离、鉴定于中国青岛地区（1999年），它在世界范围内广泛流行，也是中国2013年后最具流行优势的IBV类型。QX型IBV感染损害鸡的呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统，引发腺胃炎、肾炎等多种症状。QX型IBV对呼吸道黏膜造成严重损伤，使病鸡容易受到支原体、细菌或其他病原体的继发感染，死亡率很高。
论文的研究样本是IBV-YN，一种QX型IBV毒株，收集于2005年。研究者制作了IBV-YN的感染性克隆毒株IBV-rYN（简称为rYN），同时制作了一个IBV-YN的人工变异体（改造体）IBV-rYN-S2/RRKR（简称为rYN-S2/RRKR），rYN-S2/RRKR在IBV-YN S蛋白S2亚基融合肽（FP）上游的S2'处（第695氨基酸处）引入了一个furin酶切位点。具体改造是，将S蛋白第692~695氨基酸由“PRGR”替换为“RRKR”。rYN-S2/RRKR继承了IBV-YN S1/S2处原有的复合furin酶切位点“RRFRR”（第538~542氨基酸）。见下图：

在IBV S蛋白S2亚基FP上游S2'处引入furin酶切位点示意图
实验证明：
1、rYN-S2/RRKR对10天大的SPF胚蛋的致病能力、致命性显著增强。
a) rYN-S2/RRKR接种导致所有SPF含胚卵在接种后36 小时(hpi，hours post of the infection) 内全部死亡，相比之下，rYN则需要超过96 小时；
b) rYN-S2/RRKR 的50% 胚胎感染剂量(EID50 ，50％Embryo Infectious Dose）) 仅为rYN的十分之一；
c) 不过，rYN-S2/RRKR 的50% 组织培养感染剂量 (TCID50 ) 比rYN 高1000倍以上，rYN-S2/RRKR在CEK细胞（Chicken embryo kidney，鸡胚肾细胞）的复制相比rYN显著减少。 
注：SPF指Specific Pathogen Free，即无特定病原；SPF鸡或SPF蛋指不含国际规定的19种病原体和相关抗体的鸡或鸡蛋；SPF 胚蛋，指用SPF 鸡蛋孵化到一定日龄的内有活的胚胎的鸡蛋；
2、rYN-S2/RRKR 显著增强了对雏鸡的致病能力、致死率
a) 用一日龄SPF雏鸡进行感染致病实验。
接种（眼内接种）rYN 菌株的1日龄SPF雏鸡在接种后第5天(dpi，days post of the infection) 开始出现打喷嚏和无精打采的临床症状。在14天的实验观察期内有1只雏鸡死亡（每个观察组10只小鸡），死亡率为10%；
rYN-S2/RRKR接种组的雏鸡出现腹泻临床症状和意外的神经系统症状，如头部震颤和瘫痪。该接种组第4天出现雏鸡死亡，在观察期内，该组10只小鸡中有9只死亡，死亡率为 90%。

一日龄雏鸡感染、致病、存活实验结果
图中control组指未接种病毒的10只一日龄小鸡。
b) 用3周龄SPF小鸡进行感染致病实验。
接种rYN 菌株的3周龄小鸡在接种后第11天开始表现出无精打采，一只小鸡在第13天时死亡，死亡率为10%；
接种rYN-S2/RRKR的3 周龄小鸡在接种后第8天时开始出现头部震颤的神经症状，但没有麻痹。两只3周龄小鸡分别在第9天和第13天死亡，死亡率为20%。

3 周龄小鸡感染、致病、存活实验结果
3、解剖发现，
a) rYN和rYN-S2/RRKR均对1日龄雏鸡的呼吸和泌尿系统造成了严重损伤（rYN-S2/RRKR对肾的损伤略轻于rYN），但只有rYN-S2/RRKR造成了显著的CNS（central nervous system，中枢神经系统）损伤，例如大量小胶质细胞增生、形成小胶质细胞结节，血管周围发生炎性浸润等（神经胶质细胞是血脑屏障的构成要素）。

rYN 、rYN-S2/RRKR对一日龄雏鸡气管、肾、大脑的损伤对比
图中纵坐标代表病变严重程度评分：0 = 无显微损伤，1-3 = 轻度损伤，4-6 = 中度损伤，7-10 = 严重和广泛损伤。
线段上的“*”号代表线段端点对应的两组数据的差异程度，“*”号越多表示两组数据差异越大（该图是用GraphPad Prism7.5绘制的）。

一日龄雏鸡大脑病变、损伤的染色脑切片显微镜图像
左上子图对应控制组小鸡（未接种病毒的小鸡）；左下对应接种rYN的小鸡；中上显示了接种rYN-S2/RRKR的小鸡大脑中的大量小胶质细胞增生，及一个相当大的小胶质细胞结节；中下显示了接种rYN-S2/RRKR的小鸡大脑中血管周围的炎性浸润；右上、右下分别是中上、中下的局部放大图。
b) rYN-S2/RRKR对3周龄小鸡呼吸和泌尿系统的损伤明显轻于rYN，但仍对CNS造成严重损伤，在rYN-S2/RRKR接种组的3周龄小鸡大脑中仍然检测到大量的小胶质细胞增生和血管周围炎症浸润。

rYN 、rYN-S2/RRKR对3周龄小鸡气管、肾、大脑的损伤对比

3周龄小鸡大脑病变、损伤的染色脑切片显微镜图像
左上子图对应控制组小鸡（未接种病毒的小鸡）；左下对应接种rYN的小鸡；中上显示了接种rYN-S2/RRKR的小鸡大脑中的大量小胶质细胞增生；中下显示了接种rYN-S2/RRKR的小鸡大脑中的血管周围炎性浸润；右上、右下分别是中上、中下的局部放大图。
论文指出：
血管周围炎性浸润表明，rYN-S2/RRKR感染能破坏、突破血脑屏障（BBB，blood–brain barrier），损伤中枢神经系统（CNS），导致重症脑炎；重症脑炎是rYN-S2/RRKR感染死亡率高于rYN的原因所在。 
不过，rYN-S2/RRKR虽然增强了对不同日、周龄SPF小鸡的致死力，新获得了损伤神经系统的能力，但它同时减少了对小鸡呼吸系统和泌尿系统的损伤。
4、 IHC（Immunohistochemistry，免疫组织化学检查）结果显示，rYN接种组小鸡肾中的IBV抗原（antigen）阳性细胞多于rYN-S2/RRKR接种组；rYN-S2/RRKR接种组小鸡大脑中有大量IBV抗原阳性细胞，而rYN接种组大脑中没有IBV抗原阳性细胞。这些检查结果表明：rYN-S2/RRKR变异体在小鸡体内降低了上皮嗜性，但表现出神经嗜性。 
论文指出，引入furin-S2'位点的IBV-YN改造毒株rYN-S2/RRKR的神经嗜性，在IBV中从未报道过。

小鸡肾、脑切片中的抗原阳性细胞显微图像

小鸡肾、脑切片显微镜视野中每个切片的阳性细胞数
0 = 无阳性细胞，1 = 1-10 个阳性细胞，2 = 11-30 个阳性细胞，3 = 31-50 个阳性细胞， 4 = > 50 个阳性细胞。 肾脏中rYN阳性细胞多于rYN-S2/RRKR，而rYN和阴性对照组（控制组）的脑中均没有阳性细胞。 
5、QX型IBV 疫苗SZ130（一种QX型IBV减毒株和IBV候选疫苗）仍可提供针对rYN和rYN-S2/RRKR的有效保护。
先接种SZ130，两周后分别接种rYN或rYN-S2/RRKR的两组各10只一日龄雏鸡观察期内无一死亡，而且没有出现任何临床症状（接种rYN或rYN-S2/RRKR后的观察期为两周）。
（未完待续）
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